A titulação de anticorpos é uma das etapas da otimização de painéis de citometria de fluxo. A titulação irá determinar a melhor concentração de anticorpos capaz de gerar uma boa resolução. Ou seja, separar o sinal de fluorescência de uma população positiva em relação a população negativa, com o mínimo de interações não específicas. Além disso, a titulação irá te ajudar a economizar, já que na maioria das vezes a concentração de anticorpos encontrada após titulação é sempre menor do que a recomendada pelo fabricante.
A titulação é realizada através do teste de marcação de uma amostra com concentrações do anticorpo menores do que recomendada pelo fabricante. Após a aquisição da fluorescência é determinado a resolução da marcação através da formula matemática de stain index (figura 1).
A figura 2 e a figura 3 exemplifica o que acontece na prática. O excesso de concentração de anticorpos irá acarretar aumento do background ou marcação inespecífica. Nestes casos, ocorre o aumento da fluorescência da população negativa tomando-a mais próxima da população positiva. Isso acarreta diminuição da resolução e um menor stain index (mais a direita das figuras 2 e 3). Com a diminuição da concentração de anticorpo pode ser encontrada a concentração ótima de marcação, permitindo se ter uma maior resolução. Nesses casos se observa uma melhor separação do sinal de fluorescência da população positiva em relação a negativa e um maior stain index (região central das figuras 2). Note também na figura, que uma concentração menor de anticorpo também acarreta em menor resolução (mais a esquerda da figura 2).
Referência: DOI: 10.1002/cyto.a.24733
UWCCC Flow Cytometry Laboratory
Commenti